​广地龙古今入药品种对比研究
2020-01-01 12:29
广地龙古今入药品种对比研究
已发表于:中药材,2018,41(6):1312-1316.
孙洁1,2,魏劭恒2,毛润乾3,李志武4,曹晖1,2,乐智勇5,马志国1,2*
(1.暨南大学岭南传统中药研究中心,广东 广州510632; 2.暨南大学药学院,广东 广州510632; 3.广东省生物资源应用研究所,广东 广州510260; 4.陆川县广地龙养殖场,广西 陆川537700; 5.康美(北京)药物研究院有限公司,北京102629)
 
        摘要: 通过对中药地龙的品种考证,并整理历版中国药典及地方中药材标准,分析地龙药材收载品种的演变情况;采用性状鉴别结合分子鉴定的方法对市售广地龙的品种进行研究。结果表明本草中记载的“白颈蚯蚓”与钜蚓科远盲蚓属蚯蚓基本一致;广地龙历来都是地龙药材的收载品种;目前市售广地龙药材中,伪品较多,大腔蚓和暗孔远盲蚓为最常见的2种伪品,其能否作为广地龙使用,仍需要进一步的研究。
        关键词:地龙;品种考证;参环毛蚓;真伪鉴别;分子鉴定
        中图分类号: R282.5    文献标识码: A
        地龙是常用的动物类药材,来源于钜蚓科动物参环毛蚓 Pheretima aspergillum (E.Perrier) 、通俗环毛蚓 Pheretima vulgaris Chen、威廉环毛蚓Pheretima guillelmi (Michaelsen) 或栉盲环毛蚓 Pheretima pectinifera Michaelsen的干燥体[1]。前一种习称“广地龙”,后三种习称“沪地龙”。地龙具有清热定惊、通络、平喘、利尿、降压的功效;用于治疗高热神昏、惊痫抽搐、关节痹痛、肢体麻木、半身不遂、肺热喘咳、尿少水肿、高血压等证。我国蚯蚓品种多[2]、形态相似,因此地龙药材品种来源复杂[3],中国药典及地方标准收载的地龙品种在不同时期也有变化。文献报道,地龙药材市场的品种混杂和掺假现象较为普遍[4]。广地龙因个大、质佳,是地龙药材市场的主流品种,关于广地龙的资源调查及商品鉴定未见报道。本文通过查阅文献资料,结合目前中药材市场调查结果,进行了地龙药材的品种考证,并对商品广地龙进行真伪鉴别,为地龙临床用药的安全性和有效性,以及进一步开发利用提供参考。
1 仪器与材料
1.1仪器  PCR仪(东胜ETC811)、恒温水浴箱(Julabo TW20)、凝胶成像仪(BIORAD76S/06983)、超声波清洗机(舒美KQ5200DE)、涡旋机(其林贝尔QL-901)、微波炉(美的M3-232C)、分析天平(奥豪斯AX223ZH)、电泳仪(北京六一DYY-6C)、小型台式离心机(湘仪H1650-W )、超微量紫外/可见分光光度计(Denovix DS-11)、洁净工作台(苏净安泰SW-CJ-2FD)
1.2材料  Prime STAR® Max DNA Polymerase、DNA Loading Buffer(TAKARA)、琼脂糖(Aladdin)、动物基因组DNA提取试剂盒、DL2000 DNA Marker(北京擎科新业生物技术有限公司)、Gel Red TM(BIOTIUM)、地龙(参环毛蚓)对照药材购自中国药品生物制品检定研究院(120987-201508 ID:CEVK-JR7Y)。45批“广地龙”药材分别购自亳州药材市场、玉林药材市场、清平药材市场,样品来源信息见表1。
2 方法与结果
2.1地龙的
本草记载    地龙属于多来源的动物药,作为药材最早记载于东汉《神农本草经》,将其列为下品,称为“邱蚓”[5]。唐代《千金翼方》中描述: “白颈蚯蚓,一名土龙。生平土,三月取,阴干” [6] 。宋代《图经本草》曰:“白颈蚯蚓,生平土,今处处平泽皋壤地中皆有之。白颈是其老者耳”[7]。此外,宋代《证类本草》、明代《本草品汇精要》中均收载了“白颈蚯蚓”[8-9]。明代《本草纲目》曰:“蚓之行也,引而后申,其蝼如丘,顾名蚯蚓”[10],与现代蚯蚓的习性相符合。“白颈”为钜蚓科远盲蚓属蚯蚓所特有,在解剖位置上与其在性成熟时才出现的指环状生殖环带一致[11],这与本草中记载的“入药用白颈,是其老者”描述相一致。综上,我国多部本草著作中均收载“白颈蚯蚓”,表明“白颈蚯蚓”是古代地龙药材的主要来源品种,其来源为钜蚓科远盲蚓属蚯蚓。
2.2 资源文献调查        通过查阅历版《中华人民共和国药典》、各省中药材标准、各省中药饮片炮制规范及近现代文献记载情况,结果发现:①在1990年前文献资料记载中,包括《中华人民共和国药典》(1963年版、1977年版、1985年版、1990年版)、《辽宁省中药饮片炮制规范》(1975年版)、《江苏省中药饮片炮制规范》(1980年版)、《吉林省中药饮片炮制规范》(1986年版)、《全国中药炮制规范》(1988年版),地龙药材来源均为钜蚓科动物参环毛蚓Pheretima aspergillum (E.Perrier)或缟蚯蚓allolobophora caliginosa (Savigny) trapezoides (Ant. Deges)的干燥全体,前者习称“广地龙”,后者习称“土地龙”;只有《四川省中药饮片炮制规范》(1977年版)规定地龙来源为参环毛蚓和其他同属多种。②《上海市中药材标准》1994年版,地龙(沪地龙)项下首次将通俗环毛蚓Pheretima vulgaris Chen、威廉环毛蚓Pheretima guillelmi (Michaelsen) 、栉盲环毛蚓Pheretima pectinifera Michaelsen,定为“沪地龙”来源品种。③从《中华人民共和国药典》1995年版开始,地龙来源除了继续收载钜蚓科动物参环毛蚓Pheretima aspergillum (E.Perrier)外,增加了三种“沪地龙”即通俗环毛蚓Pheretima vulgaris Chen、威廉环毛蚓Pheretima guillelmi (Michaelsen) 、栉盲环毛蚓Pheretima pectinifera Michaelsen,并取消了“土地龙”缟蚯蚓这一来源,随后历版 《中华人民共和国药典》 修订时地龙来源均未再做更改。《广西壮药质量标准(第二卷)》及2003-2015年间各省出版的《中药饮片炮制规范》中地龙来源均与现行《中华人民共和国药典》一致。
2.3广地龙商品药材DNA分子鉴定        采用聚合酶链式反应法[12-13],利用16S rRNA和COI序列对各批广地龙进行分子鉴定。
2.3.1 基因组DNA提取  用动物基因组DNA提取试剂盒(北京擎科新业生物技术有限公司)提取各批次地龙样品及广地龙对照药材的DNA,并通过电泳检测DNA的质量。
2.3.2 聚合酶链式反应        引物:扩增COI基因的引物为LCO1490/HCO2198[14],扩增16S rRNA基因的引物为 16Sar/16Sbr[15],聚合酶链式反应体系与程序如下:在200 μL离心管中进行,反应总体积为50 μL,反应体系包括:PrimeSTAR Max Premix(2×)25 μL,鉴别引物(10 ~ 15 pmol)0.2-0.3 μL,模板小于200 ng,灭菌蒸馏水添加至50 μL。 将离心管置PCR仪,聚合酶链式反应参数:COI基因片段: 95℃预变性5 min,循环反应40次(95℃ 45秒,54℃45秒,72℃45秒),延伸(72℃)10 min。16S rRNA基因片段:95℃预变性5 min,循环反应40次(95℃ 45秒,57.2℃ 45秒,72℃45秒),延伸(72℃)10 min。
2.3.3 电泳检测        照《中华人民共和国药典》2015年版四部琼脂糖凝胶电泳法(通则0541),胶浓度为1% ,胶中加入核酸凝胶染色剂Gel Red,供试品与对照药材PCR反应溶液的上样量分别为10 μL,DNA分子量标记上样量为2 μL(0.5 μg/μL)。电泳结束后,取凝胶片在凝胶成像仪上或紫外透射仪上检视。供试品凝胶电泳图谱中,在与对照药材凝胶电泳图谱相应的位置上,在400〜500bp(16S rRNA)、600-700bp之间(COI)应各有一条DNA 条带。结果见图1。

图1 部分样品的16S rRNA基因(A)和COI基因(B)扩增凝胶电泳图
Figure 1 16S rRNA gene(A) and COI gene (B)amplification gel electrophoresis of some samples
        从图1可知,1-5号供试品用16S rRNA基因扩增后的凝胶电泳图在400-500bp之间有单一DNA条带,用COI基因扩增后的凝胶电泳图在600-700bp之间有单一DNA条带。
2.3.4 DNA条带分析 分别回收上述两条DNA条带,经纯化后送北京擎科新业生物技术有限公司测序,双向测通,测序结果进行NCBI在线BLAST比对与同源性分析。结果表明,1-15号样品与参环毛蚓相似度达98%以上;16-29号样品与大腔蚓相似度达98%以上;30-45号样品未比对出相同的条形码基因。
        综合药材性状与分子鉴定结果,确定其中1-15号样品为钜蚓科远盲蚓属参环毛蚓Pheretima aspergillum (E.Perrier) ;16-29号样品为钜蚓科腔蚓属大腔蚓Metaphire magna (Chen);30-45号样品为钜蚓科远盲蚓属暗孔远盲蚓Amynthas obscuritoporus (Chen),结果见表1。 
表1 广地龙商品药材调查情况表
Table 1 Survey on the commercial drugs of Guang Dilong.
NO. 购买地 产地 鉴定结果
1 玉林 广西 参环毛蚓Pheretima aspergillum (E.Perrier)
2 玉林 广西 参环毛蚓Pheretima aspergillum (E.Perrier)
3 亳州 广西 参环毛蚓Pheretima aspergillum (E.Perrier)
4 亳州 广西 参环毛蚓Pheretima aspergillum (E.Perrier)
5 亳州 广西 参环毛蚓Pheretima aspergillum (E.Perrier)
6 清平 广西 参环毛蚓Pheretima aspergillum (E.Perrier)
7 清平 广西 参环毛蚓Pheretima aspergillum (E.Perrier)
8 玉林 广西 参环毛蚓Pheretima aspergillum (E.Perrier)
9 玉林 广西 参环毛蚓Pheretima aspergillum (E.Perrier)
10 玉林 广西柳州 参环毛蚓Pheretima aspergillum (E.Perrier)
11 玉林 广西玉林 参环毛蚓Pheretima aspergillum (E.Perrier)
12 玉林 广西钦州 参环毛蚓Pheretima aspergillum (E.Perrier)
13 玉林 广东茂名 参环毛蚓Pheretima aspergillum (E.Perrier)
14 玉林 广东 参环毛蚓Pheretima aspergillum (E.Perrier)
15 清平 未知 参环毛蚓Pheretima aspergillum (E.Perrier)
16 亳州 海南万宁 大腔蚓Metaphire magna (Chen)
17 亳州 海南琼海 大腔蚓Metaphire magna (Chen)
18 亳州 海南 大腔蚓Metaphire magna (Chen)
19 亳州 海南 大腔蚓Metaphire magna (Chen)
20 清平 海南 大腔蚓Metaphire magna (Chen)
21 清平 海南 大腔蚓Metaphire magna (Chen)
22 清平 海南 大腔蚓Metaphire magna (Chen)
23 清平 海南 大腔蚓Metaphire magna (Chen)
24 玉林 海南 大腔蚓Metaphire magna (Chen)
25 玉林 海南 大腔蚓Metaphire magna (Chen)
26 亳州 海南 大腔蚓Metaphire magna (Chen)
27 亳州 海南 大腔蚓Metaphire magna (Chen)
28 亳州 海南 大腔蚓Metaphire magna (Chen)
29 亳州 海南 大腔蚓Metaphire magna (Chen)
30 亳州 广西百色 暗孔远盲蚓Amynthas obscuritoporus (Chen)
31 亳州 广西博白 暗孔远盲蚓Amynthas obscuritoporus (Chen)
32 玉林 广西北流 暗孔远盲蚓Amynthas obscuritoporus (Chen)
33 玉林 广西容县 暗孔远盲蚓Amynthas obscuritoporus (Chen)
34 玉林 广西博白 暗孔远盲蚓Amynthas obscuritoporus (Chen)
35 亳州 广西 暗孔远盲蚓Amynthas obscuritoporus (Chen)
36 亳州 广西 暗孔远盲蚓Amynthas obscuritoporus (Chen)
37 亳州 广东阳江 暗孔远盲蚓Amynthas obscuritoporus (Chen)
38 亳州 广西 暗孔远盲蚓Amynthas obscuritoporus (Chen)
39 亳州 广西 暗孔远盲蚓Amynthas obscuritoporus (Chen)
40 亳州 广西 暗孔远盲蚓Amynthas obscuritoporus (Chen)
41 玉林 广西 暗孔远盲蚓Amynthas obscuritoporus (Chen)
42 亳州 广东茂名 暗孔远盲蚓Amynthas obscuritoporus (Chen)
43 亳州 广东茂名 暗孔远盲蚓Amynthas obscuritoporus (Chen)
44 玉林 广东 暗孔远盲蚓Amynthas obscuritoporus (Chen)
45 玉林 广东 暗孔远盲蚓Amynthas obscuritoporus (Chen)
        由以上结果可知,目前市场上广地龙商品来源主要有3种,除了正品参环毛蚓外,大腔蚓和暗孔远盲蚓也在市场上作为广地龙流通和使用。其中,参环毛蚓主产于广西,其次为广东;大腔蚓主产于海南;暗孔远盲蚓主产于广西,其次为广东。
 2.4广地龙商品药材性状比较        根据以上鉴定结果,对3种药材进行性状比较,结果见图2、表2。

1暗孔远盲蚓(Amynthas obscuritoporus);2大腔蚓(Metaphire magna);3参环毛蚓(Amynthas aspergi llum)A外侧;B 内侧
图2 广地龙及其伪品的性状比较图
1. Amynthas aspergillum; 2.Metaphire magna; 3. Amynthas obscuritoporus  A. outside; B. Inside
Figure 2 Pictures of Guang Dilong and its adulterants  
表2     广地龙及其伪品的性状比较
Table2 Comparison of macroscopic characters of Guang Dilong and its adulterants 
品种 性状特征
参环毛蚓
Amynthas aspergillum
呈长条状薄片,弯曲,边缘略卷,长15-20cm,宽1-2 cm。全体具环节,背部棕褐色至紫灰色,腹部浅黄棕色;略呈革质,不易折断,气腥,味微咸。
大腔蚓
Metaphire magna
呈长条状薄片,弯曲,边缘略卷,长15-35cm,宽1-2 cm。全体具环节,背部、腹部均为浅黄棕色;肉质厚,纤维较多,略呈革质,不易折断,气腥,味微咸。
暗孔远盲蚓
Amynthas obscuritoporus
呈长条状薄片,弯曲,边缘略卷,长15-35cm,宽1-2 cm。全体具环节,背部、腹部均为黑褐色;肉质较厚,呈革质,不易折断,气腥,味微咸。
 
3 讨论
3.1 本草中所记载的“白颈蚯蚓”应为钜蚓科远盲蚓属蚯蚓。法定标准中收载的地龙药材来源,在1990年前为参环毛蚓(广地龙)和缟蚯蚓(土地龙)2种;1994年上海市中药材标准首次收录“沪地龙”,来源为通俗环毛蚓、威廉环毛蚓、栉盲环毛蚓;1995年开始地龙药材来源继续收录“广地龙”(参环毛蚓),但“土地龙”缟蚯蚓不再收录,被“沪地龙”(通俗环毛蚓、威廉环毛蚓、栉盲环毛蚓)取代,可见参环毛蚓历来都是地龙药材的正品来源。
3.2 样品DNA提取以及扩增效果的考察。本实验曾对孵育时间、孵育温度、退火温度、循环次数等单因素进行考察。结果发现,孵育浸泡12h,孵育温度56℃提取的基因组DNA效果最好,孵育时间过短,易降低DNA提取率,孵育时间达到一定程度后,继续增加时间DNA提取率不会增加。孵育温度过低DNA提取率较低,孵育温度过高易影响蛋白酶K的活性,导致DNA的含量和纯度受到影响,从而降低DNA的提取率。退火温度过高易导致酶变性失活,影响扩增效果,退火温度低易导致非特异性结合。循环次数过低,PCR产物相对较少,循环次数过多,会增加非特异产物。
3.3 通过市场调查发现,市售广地龙商品中伪品多于正品;文献报道参环毛蚓主产于广东、广西、海南、福建、台湾[17],通过市场调查发现目前参环毛蚓最主要产地为广西,其次为广东,未发现产地为海南、福建、台湾的参环毛蚓。大腔蚓和暗孔远盲蚓为最常见的2个伪品,其中大腔蚓产地为海南;暗孔远盲蚓市场上俗称“山地龙”,主要产地为广西,其次为广东。另外,在药材批发市场还收集到产地为越南的广地龙样品1批,通过分子鉴定确定其来源非参环毛蚓,属于伪品,但具体品种需进一步研究。大腔蚓和暗孔远盲蚓作为市场最常见的2种广地龙伪品,能否作为广地龙药材使用,仍需要进一步从安全性和有效性方面进行评价。 
参考文献
[1]国家药典委员会. 中华人民共和国药典[S]. 一部. 北京:中国医药科技出版社,2015 : 122- 123.
[2]冯孝义.中国陆栖蚯蚓各属的分类特征[J].动物学杂志,1985,20(1):44- 47.
[3]陈平,叶卯祥,严宜昌,王克勤.中药地龙的药源调查与商品鉴定[J].中草药,1997,28(8):492- 495.
[4]郭利霄,王乾,张丹,等.不同产地地龙药材的微性状鉴别及品质研究[J].中药材,2018,41(1):67- 70.
[5]吴普.神农本草经.卷三[M]. 北京:人民卫生出版社,1963:123.
[6]孙思邈.千金翼方[M]. 沈阳:辽宁科学技术出版社,1997:43.
[7]苏颂.图经本草[M].福州:福建科学出版社,1988:463.
[8]唐慎微.重修政和经史证类备用本草[M]. 北京:人民卫生出版社,1957:445
[9]刘文泰.御制本草品汇精要[M].上海:上海科技出版社,2005:1024.
[10]李时珍.本草纲目.下册[M]. 北京:中国中医药出版社(金陵本)新校注, 2013:1265.
[11]陈平,傅杰,严宜昌.地龙的本草考证[J].中药材,1997, 20(3):158- 160.
[12]马梅,李薇,龚玲,等.基于COI和16S rRNA基因的地龙药材及其混淆品的DNA条形码鉴定[J].中药新药与临床药理,2014,25(5):595- 598.
[13]韦健红,李薇,吴文如,等.基于COI与16S rRNA基因对广地龙的DNA分子鉴定研究[J].中国药房,2012,23(35):3274-3278.
[14]马梅,李薇,龚玲,卢瑞珊,韦健红.广地龙药材DNA提取方法的优选[J]. 时珍国医国药,2014,25(6):1404- 1406.
[15] Folmer O, Black M, Hoeh W, et al. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome coxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates[J]. Molecular marine biology and biotechnology, 1994, 3(5): 294-299.
[16]Andersen N M, Cheng L, Damgaard J, et al. Mitochondrial DNA sequence variation and phylogeography of oceanic insects (Hemiptera: Gerridae: Halobates spp.)[J]. Marine Biology, 2000, 136(3): 421-430.
[17]曾中平,张国城, 徐芹 .蚯蚓养殖学[M].武汉:湖北人民出版社,1982.

  • 作者:中国药学会药学史